本试验采用高效液相色谱-示差折光(HPLC-RID)和高效液相色谱-荧光(HPLC-FLD)法，研究建立混合型饲料添加剂中猪胆酸、猪去氧胆酸、鹅去氧胆酸含量的高效液相色谱测定方法，并对2种高效液相色谱法、重量法、容量法胆汁酸含量测定结果进行比较分析。HPLC-RID法：试样用甲醇-乙腈-水溶液提取，C18柱分离，HPLC-RID测定，3种胆汁酸的定量限为10.0-20.0mg/g,平均回收率为82.54%-108.50%，相对标准偏差(RSD)为2.90%-7.61%；HPLC-FLD法：试样用甲醇提取，氢氧化钾甲醇溶液皂化，以1,4,7,10,13,16-六氧杂环十八烷乙腈液和4-溴甲基-7-甲氧基香豆素乙腈液衍生，C18柱分离，HPLC-FLD测定，3种胆汁酸的定量限为2.0-3.0mg/g，平均回收率为70.43%-84.31%，RSD为4.82%-9.80%。结果表明：HPLC-RID法、HPLC-FLD法均可测定混合型饲料添加剂中的3种胆汁酸含量，但由于HPLC-FLD法胆汁酸需要衍生，易受样品基质影响，胆汁酸含量测定结果重现性、稳定性差；重量法、容量法测定的是混合型饲料添加剂中所有胆汁酸的总含量，但由于方法特性所限，容量法测定结果不能准确反映产品所有胆汁酸的总含量。本研究建立的HPLC-RID法重现性、稳定性、可信度高，适用于混合型饲料添加剂中猪胆酸、猪去氧胆酸和鹅去氧胆酸含量的测定；重量法适用于混合型饲料添加剂中胆汁酸总含量的测定。

目前，国内外文献报道有关胆汁酸含量测定方法主要有薄层色谱法、分光光度法、高效液相色谱法、气相色谱质谱联用法和液相色谱质谱联用法。薄层色谱法需要复杂的纯化前处理，其结果易受试验条件影响；分光光度法操作简单，但无法准确定量测定3种胆汁酸含量；气相色谱质谱联用法需要进行复杂的衍生处理，液相色谱质谱联用法样品需要净化处理，灵敏度均特别高，不适合含量较高的饲料添加剂胆汁酸定量分析；高效液相色谱法样品前处理简单，线性范围、灵敏度等更适合混合型饲料添加剂胆汁酸主成分含量检测。本试验研究建立混合型饲料添加剂中3种胆汁酸含量的高效液相色谱-示差折光( HPLC-RID)法、高效液相色谱-荧光( HPLC-FLD)法，并与现有的重量法、容量法进行对比，明确4种方法的测定原理、测定对象、测定结果的差异，旨在为饲料和饲料添加剂生产企业选择适宜的混合型饲料添加剂中胆汁酸含量检测方法、加强混合型饲料添加剂胆汁酸产品质量控制及其科学规范使用提供技术支撑。

HPLC-FLD和HPLC-RID方法比较

采用HPLC-FLD和HPLC-RID２种方法测定样品中３种胆汁酸含量测定结果（见表1），HPLC-RID法均较HPLC-FLD法高，这可能是由于HPLC-FLD法前处理较复杂，需要皂化、衍生后进行HPLC测定，皂化、衍生过程易产生损失，方法回收率、重复性均较HPLC-RID法低，使其最终总含量略低于HPLC-RID法。经过多次试验发现，HPLC-RID法和HPLC-FLD法检测３种胆汁酸的定量限相差数倍，这是基于检测器本身引起的差异，示差折光检测器的检测基于被分析物的折光指数的差异，即测量样品流路与参比流路在折光指数上的差别，其灵敏度较低、选择性较差，对流速、温度及黏度的变化敏感；而荧光检测器是一种高灵敏的选择性检测器，它适用于检测物质本身具有荧光或为了提高灵敏度将没有荧光的物质衍生成荧光衍生物；由于饲料添加剂胆汁酸含量较高，HPLC-RID的检出限、线性范围均可以满足混合型饲料添加剂胆汁酸主成分含量的检测需要。另外，试验发现，HPLC-FLD法容易受混合型饲料添加剂载体影响，因为混合型饲料添加剂胆汁酸产品大多会使用麦饭石、糠、淀粉等作为载体，每家生产企业配方可能不一样，HPLC-FLD法衍生过程中易受载体基质等影响，造成胆汁酸衍生反应不稳定、衍生效果不稳定，最终导致３种胆汁酸响应值不稳定，特别容易引起批间测定结果差别大，方法重复性和再现性差；HPLC-RID法前处理非常简单，仅需要用流动相提取后直接进行HPLC分析，方法稳定性好，非常适合混合型饲料添加剂中的猪胆酸、猪去氧胆酸、鹅去氧胆酸含量的测定。

HPLC-RID法、HPLC-FLD法、重量法和容量法之间的比较

采用HPLC-RID法、HPLC-FLD法、重量法和容量法对混合型饲料添加剂胆汁酸样品进行胆汁酸总含量的测定（见表2），容量法胆汁酸总含量测定结果最高，重量法次之，而HPLC-FLD法、HPLC-RID法相对偏低。这主要是因为４种方法的原理不同，重量法用乙醇-氢氧化钠水解试样、乙醚提取所有胆汁酸，回收乙醚后干燥，重量法得到混合型饲料添加剂胆汁酸产品的总胆汁酸含量，因各混合型饲料添加剂胆汁酸产品原料来源不一，生产工艺差异大，混合型饲料添加剂胆汁酸产品除含有《饲料添加剂品种目录》规定的猪胆酸、猪去氧胆酸、鹅去氧胆酸外，还可能含有胆酸、去氧胆酸、石胆酸等10多种胆汁酸；而容量法用氢氧化钠标准溶液滴定，滴定过程会中和混合型饲料添加剂胆汁酸产品中所有无机酸和有机酸，含量最高；HPLC-RID法、HPLC-FLD法可对猪胆酸、猪去氧胆酸、鹅去氧胆酸等３种胆汁酸进行准确定性定量分析，仅测定这３种胆汁酸的总含量。混合型饲料添加剂胆汁酸生产企业、饲料企业可根据自身实验室条件和检测需要选择适宜的胆汁酸含量测定方法。

1.若针对混合型饲料添加剂胆汁酸产品中猪胆酸、猪去氧胆酸、鹅去氧胆酸的含量进行检测，HPLC-RID法、HPLC-FLD法均可准确测定。但HPLC-FLD法测定结果重复性和再现性差，建议选择前处理更简单、稳定性好的HPLC-RID测定混合型饲料添加剂胆汁酸产品中猪胆酸、猪去氧胆酸、鹅去氧胆酸含量。

2.若针对混合型饲料添加剂胆汁酸产品中的所有胆汁酸的总含量检测，由于容量法滴定中和产品中所有的无机酸和有机酸，测定结果不能正确反映产品中所有胆汁酸的总含量，建议采用《中华人民共和国药典(2015年版一部)》规定的重量法(猪胆粉法)测定混合型饲料添加剂胆汁酸产品中的胆汁酸总含量。

原文：聂倩倩,王鑫,杨发树,等.混合型饲料添加剂中胆汁酸含量测定方法比较研究[J].动物营养学报,2024,36(03):1942-1951.

作者:聂倩倩,王鑫,杨发树,等

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