摘要
青岛柯能集团联合黄海水产研究所、中国海洋大学共同完成的一项研究，阐明了溶血卵磷脂（LPC）对摄入高脂饲料的大菱鲆幼鱼肠道健康的调控作用及机制，该研究发表于国际知名期刊《Nutrients》。
本实验在高脂（16%）基础饲料中分别添加0%、0.1%、0.25%及0.5%的溶血卵磷脂（LPC0、LPC0.1、LPC0.25、LPC0.5），进行为期8周的养殖实验。研究结果显示：在添加LPC的处理组中，肠道组织形态观察中没有出现固有层变宽和炎性细胞浸润的现象。添加LPC明显降低了TLRs（TLR3、TLR8、TLR9和TLR22）、MyD88和信号分子（NF-κB、JNK和AP-1）的基因表达。同样，不同水平LPC的添加也明显抑制了NF-κB和JNK信号通路下游因子（TNF-α、IL-1β、Bax、Caspase9和Caspase-3）的基因表达。这些基因表达结果表明了LPC对肠道粘膜屏障功能的改善作用。此外，高脂饲料中添加LPC也改变了肠道微生物的组成结构，上调了短链脂肪酸产生菌、乳酸菌和消化相关菌的相对丰度。肠道微生物的功能预测结果表明，与对照组相比，饲料中添加了LPC的大菱鲆幼鱼在脂质代谢和免疫系统等通路上的相对丰度更高，而在代谢性疾病和免疫系统疾病等通路的富集程度相对更低。总之，LPC可以通过TLR信号途径调控大菱鲆肠道粘膜免疫和机械屏障功能，并且改善了肠道微生物的组成和功能。
（原文标题：Effects of lysophosphatidylcholine on intestinal health of turbot fed high-lipid diets）
1）LPC显著改善了大菱鲆肠道组织损伤
如图1E,F所示，在LPC0组的后肠中观察到混合白细胞的浸润，固有层增宽，以及排列混乱的微绒毛，但在添加LPC的处理组中未观察到这些症状。与LPC0组相比，添加了LPC的3个处理组的肠道粘膜皱褶高度（hMF）和粘膜肌层厚度（hMM）显著增加，而微绒毛高度（hMV）和周长比（PR）仅分别在LPC0.1和LPC0.5组发生明显增加（P < 0.05）（图2）。
图1 各组后肠组织形态观察
（A）、（B）、（C）、（D）的比例尺 = 500 μm，（E）、（F）、（G）、（H）的比例尺 = 50 μm。染色：苏木精伊红染色H&E。红星显示混合白细胞浸润在固有层（LP）中。MF：黏膜褶皱；MM：肌层粘膜；MV：微绒毛（黑色箭头）。
图2 肠道组织学测量参数
实验数据表示为平均值±标准误，不同的上标字母表示显著差异（p < 0.05）。MF：黏膜褶皱；MM：肌层粘膜；MV：微绒毛；PR：周长比。
2）肠道屏障基因表达表明LPC改善了肠道粘膜屏障功能
饲料中添加0.1-0.5%LPC显著降低了TLR3、TLR8、TLR9和TLR22的基因表达水平（P < 0.05）（图3A）；LPC的添加显著下调了髓样分化蛋白88（MyD88）和TLR信号通路的下游调节分子，如IRF3、NF-κB、JNK和AP-1的基因表达水平（P < 0.05）（图3B）；饲料中添加LPC显著下调IL-1β和TNF-α的基因表达，而0.1%和0.25%的LPC可明显下调IFN-γ的表达（P < 0.05）（图3C）；饲料中添加LPC显著下调了促凋亡分子，包括Bax、Caspase-9和Caspase-3的基因表达水平（P < 0.05）。与LPC0组相比，添加0.1%和0.25%LPC的处理组中，PCNA的基因表达水平明显上调（P >0.05）（图3D）。
图3 溶血卵磷脂对大菱鲆后肠TLR信号通路和肠粘膜屏障相关因子的基因表达的影响
（A-B）Toll 样受体（TLR）、衔接蛋白和下游调节分子;（C）炎性细胞因子;（D）上皮细胞凋亡与增殖。实验数据表示为平均值± 标准误，不同的字母表示显著性差异（P < 0.05）
3）LPC改变了肠道微生物的组成结构
每组四个样品共16个样品的基因组DNA经过组装、质量控制和拼接，共获得1,008,526个高质量的有效标签，聚类为12,240个OTU，序列相似度超过97%。稀疏曲线和物种积累图结果显示，所有样品能满足测序深度（图4A，B）。文氏图显示，所有组别共有1228个OTUs，LPC0、LPC0.1、LPC0.25和LPC0.5组别中的独特OTU数量分别为584、906、1290和1534（图4C）。
门水平上，Proteobacteria和Firmicutes为优势菌门，且在所有组别中，Bacteroidetes的相对丰度仅次于它们。属水平上，前10优势菌属包括Mycoplasms、Ralstonia、Bacteroides、Prevotella、Fusobacterium、Alteromonas、Escherichia-Shigella、Alistipes、Faecalibacterium和Parvimonas（图4D、E）。与对照组相比，添加LPC的处理组中的Firmicutes与Bacteroidetes（F/B）的比例更低（P >0.05）（图4F）。α-多样性分析的结果显示，添加0.25%和0.5%LPC的饲料显著提高了大菱鲆肠道菌群的丰富度（observed species、Chao1和Ace）（P < 0.05）。饲料中添加0.1%LPC虽也上调了丰富度指数，但与对照组相比没有显著性差异（p > 0.05）。此外，在LPC0.25组中观察到Shannon指数显著增加（P < 0.05）（图5）。
AMOVA检验的结果显示，补充LPC组的肠道微生物群落概况与LPC组有明显不同（分别为P = 0.026、0.006和0.028）。同样，PCoA图、NMDS图和UPGMA的结果显示，添加LPC的处理组的大菱鲆肠道细菌组成与LPC0组之间有明显的区别（图6）。
图4 不同分类水平上的相对丰度图
（A）稀释曲线;（B）物种积累箱线图;（C）Veen图;（D-E）门和属水平的Top10;（F）厚壁菌门/拟杆菌门的比值。
图5 实验大菱鲆肠道微生物群的α多样性
实验数据表示为平均值± 标准误，不同的字母表示显著性差异（P < 0.05）。
图6 实验大菱鲆肠道微生物群的β多样性(PCoA图, NMDS图, AMOVA检验）
4）LPC上调了多种潜在有益菌的相对丰度
对肠道菌群进行了MetaStat分析，以比较所有组间属和种水平的肠道细菌的相对丰度。在补充LPC的组中，一些潜在的有益细菌的相对丰度，如Faecalibacterium, Pseudomonas, Blautia, Bacillus, Lactobacillus, Ligilactobacillus, Pseudoalteromonas, Parasutterella, Bifidobacterium等，都显著增加（P < 0.05）（图7A-C）。种水平上，饲料中添加LPC明显增加了Faecalibacterium prausnitzii、Bacillus velezensis、Lactobacillus murinus、Lactobacillus lindneri、Anaerostipes hadrus、Roseburia inulinivorans、Weissella cibaria、Lactobacillus plantarum、Phascolarctobacterium faecium等的相对丰度（P < 0.05）（图7D，E）。
图7不同分类水平上各组间实验大菱鲆后肠的metastat分析
（A-C）属水平肠道微生物群中的潜在有益细菌：（A）短链脂肪酸生产者、（B）乳酸生产者、（C）消化酶产生细菌；（D-E）种水平上肠道微生物群中的潜在有益细菌：（D）短链脂肪酸生产者、（E） 乳酸生产者。*表示T检验结果显示LPC0组与LPC0.1，LPC0.25或LPC0.5组之间的存在显著差异（*P < 0.05，**P < 0.01，*** P < 0.001）
5）LPC在脂质代谢和免疫系统等通路上的相对丰度更高，而在代谢性疾病和免疫系统疾病等通路的富集程度相对更低
根据PICRUSt预测的KEGG orthologies（KOs），热图结果显示，LPC处理组的肠道微生物在功能上与LPC0组有所不同（图8）。level 2中，与对照组相比，添加LPC的处理组中，能量代谢、脂质代谢、氨基酸代谢、内分泌系统、转录、细胞运动、信号转导、免疫系统和信号分子，以及相互作用等代谢通路富集，而核苷酸代谢、复制和修复、代谢性疾病、翻译和免疫系统疾病等代谢通路丰度有所降低。Level3中，与对照组相比，参与氧化磷酸化、丁酸盐代谢、精氨酸和脯氨酸代谢、甲烷代谢以及丙氨酸、天门冬氨酸和谷氨酸代谢的基因在添加LPC的处理组中表达相对更丰富。然而，与LPC0组相比，DNA复制蛋白、核糖体、氨基酸tRNA生物合成、糖酵解/葡萄糖生成、氨基酸相关酶、嘧啶代谢和嘌呤代谢等功能的相对丰度在LPC处理组中降低。
图8 基于level 2（A）和level 3（B）KEGGs的功能预测结果
1） 饲料中添加0.1-0.25%LPC对摄入高脂饲料的大菱鲆肠道健康有一定的保护作用。
2） LPC可以通过TLR介导的NF-κB途径参与调节大菱鲆肠道的免疫，以及TLR介导的JNK和p38信号途径调节机械屏障。
3） 大菱鲆肠道微生物对饲料中添加LPC 积极响应，对肠道菌群的结构和组成具有正向的改善作用。